Teorie

Mikroskopie atomárních sil (AFM) využívá "mechanického" působení, ke kterému dochází mezi měřeným vzorkem a nosníkem s hrotem. Nosník je asi 100 um dlouhý kvádřík (zpravidla z křemíku nebo jeho nitridu), který je dostatečně ohebný (a tedy i tenký). Na jeho konci je kolmo upevněn pyramidální hrot ze stejného materiálu, který je vysoký přibližně 10 um a poloměr zaoblení jeho konce je 10 nm. V této sestavě hrot určuje maximální dosažitelné rozlišení mikroskopu a přímo interaguje se vzorkem, zatímco nosník umožňuje přenos informace o interakci do okolí. Teoreticky lze dosáhnout subatomární rozlišení pro velmi hladké vzorky, v praxi maximální rozlišení závisí na vzorku (rutinně lze dosáhnout 1 nm laterální rozlišení u biologických vzorků).

Před měřením se nosník přiblíží k povrchu vzorku a zůstává neohnutý. Na začátku měření operátor zvolí určitou hodnotu ohnutí nosníku a přiblíží nosník ke vzorku natolik, aby se vlivem vzájemného působení ohnul na zvolenou hodnotu,  a mikroskop začne nosníkem pohybovat po řádku (skenovat) v rovině rovnoběžné se vzorkem. Pokud povrch není rovný, budou nerovnosti měnit velikost ohnutí nosníku. Najede-li hrot např. na výstupek, způsobí tím větší ohnutí nosníku. Vyhodnocovací systém mikroskopu na zvýšení ohnutí zareaguje tím, že celý nosník odtáhne směrem od vzorku tak, aby ohnutí dosáhlo původní hodnoty. Velikost odtažení nese tedy informaci o výši vzorku v daném bodě. Sestavíme-li jednotlivá měření do dvojrozměrné matice, získáme trojrozměrný obraz povrchu vzorku.

Výše uvedený způsob měření vyžaduje přímý dotek mezi hrotem a vzorkem a může vést u měkkých vzorků (např. buňky, biomolekuly) k jejich poškození či deformaci obrazu. Proto se používají i další, bezdotekové režimy, které využívají působení interatomárních van der Waalsových sil (odtud název metody). Tyto metody jsou ovšem složitější na popis i interpretaci obrazu.

Obr. 1 Schéma principu AFM. Ohyb nosníku je zde detekován pomocí odrazu laserového svazku a kvadrantním detektorem (prvky v zobrazení nejsou v měřítku).

Obr. 2 Fotografie hlavy mikroskopu. Systém hrotu s nosníkem je umístěn ze spodní strany pod bílou osovou částí. Dvě bílé trubičky skrývají piezokeramiku, která se využívá k realizaci skenovacího pohybu v rovině rovnoběžné se vzorkem. Vrchní kovová část slouží k manipulaci s přístrojem, v pozadí zakrývá pomocnou videokameru, která se používá k orientaci vzorku před měřením. Výška hlavy je asi 15 cm. Mikroskop je dále vybaven elektronikou a napojen na počítač.

Biologické aplikace

Biologické aplikace metody AFM zahrnují celou řadu oblastí. Doteková metoda se používá k analýze tvrdých tkání, např. kostí nebo zubů, u kterých nehrozí jejich poškození. Oproti elektronové mikroskopii není třeba vzorky pokovovat, takže se zkoumá jejich skutečný povrch, a měření není prováděno ve vakuu, což usnadňuje manipulaci se vzorkem. Nevýhodou je menší rozsah mikroskopu ("zorného pole") a požadavek relativně hladkého vzorku.

Bezdoteková metoda umožňuje měření měkkých tkání, jako je např. povrch buňky včetně studia jeho mechanických vlastností (pružnosti), či studium jednotlivých biomolekul. Studují se především proteiny, nukleové kyseliny apod. Při těchto měřeních nelze sledovat složení molekul (tedy atomární úroveň), ale lze stanovovat jejich rozměry a prostorové uspořádání. Často je měření prováděno v kapalném prostředí, které odpovídá nativnímu prostředí daného vzorku a nedochází tak k destrukci prostorové struktury, oxidaci apod. Vzhledem k této přirozenosti lze také sledovat dynamické procesy na membránách apod. Při všech měřeních však musí být vzorek pevně uchycen k podkladové vrstvě, zpravidla slídové destičce, jinak by mohlo dojít k jeho posunutí či uchycení na hrotu. Uchycení se zpravidla dosahuje pomocí chemického navázání.

U biomolekul umožňuje AFM měřit např. interakce receptoru s ligandem na úrovni jedné molekuly nebo bakteriálních adhesinů s receptory buněčných povrchů hostitelské buňky.

Metoda AFM obecně není citlivá na chemickou podstatu vzorku. Naneseme-li však na hrot nějakou chemicky či biologicky aktivní látku, budou se měnit síly působící na hrot v různých místech vzorku a získáme tím možnost mapovat oblasti s různou aktivitou. Vynechejme nyní skenovací pohyb, a posuňme hrot ke vzorku. Bude-li vzorek obsahovat molekulární řetězce, je možné, že se na hrot jeden přichytí. Začneme-li hrot odtahovat, bude se tento řetězec natahovat a tím i působit silou na nosník, který se tudíž ohne. V určitém okamžiku se řetězec odtrhne a nosník se narovná. Známe-li parametry nosníku, můžeme ze změřených dat určit sílu vazby mezi řetězcem a hrotem na úrovni jediné molekuly. 

Obr. 3 Snímek nukleové kyseliny. Vidět jsou jednotlivé řetězce nukleové kyseliny uchycené na slídě.