Fluorescenční mikroskopie

Fluorescenční mikroskopie umožňuje zobrazit určité látky obsažené v buňkách často v minimálním množství. Metoda je založena na skutečnosti, že některé chemické látky (fluorochromy) po dopadu světla o kratší vlnové délce září světlem o delší vlnové délce - tedy světlem jiné barvy. Tento jev se nazývá fluorescence. Je projevem intramolekulové energetické změny vzbuzené v látce absorbovaným zářením.

Princip nejčastěji užívaného postupu spočívá ve vazbě fluorochromu na určitou buněčnou složku (polysacharid, protein), která pak např. v modrém budícím světle září světlem žlutým. Aby modré světlo budící fluorescenci nevadilo při pozorování, musí být odstraněno bariérovým filtrem. Ten pohltí modré světlo vycházející z preparátu do objektivu a do okuláru propustí jen světlo žluté. Výsledkem je tedy obraz žlutě zářících struktur v temném poli.

Varianta této metody s použitím mnoha různých fluorochromů se užívá k vizualizaci buněčných jader, chromozomů, jadérek, cytoskeletu a jeho složek, specifických buněčných antigenů a dalších struktur. V mikrobiologii slouží k mikroskopickému průkazu mikroorganismů v klinických vzorcích (sputum, moč, kožní šupiny aj.). V imunodiagnostice se užívá k detekci buněčných antigenů sdružených s určitými chorobami. Podstata této imunofluorescenční metody je v tom, že molekuly protilátky (zpravidla monoklonální) označené navázaným fluorochromem se specificky vážou s molekulami buněčných a tkáňových antigenů, čímž vznikají komplexy (antigen+protilátka+fluorochrom), které ve vhodném budícím záření v mikroskopu fluoreskují a tím indikují přítomnost antigenu v buňce či tkáni.

Fluorescenční mikroskopické metody se stále více uplatňují diagnostickými aplikacemi v klinice. Perspektiva jejich přínosu je založena na skutečnosti, že teoreticky umožňují vizualizovat kterýkoli genový produkt na buněčné úrovni.

Fotogalerie

Řez mozkem člověka postiženého mykózou. Houbové buňky vyplňují lumen cévy a prorůstají její stěnu. Mozková tkáň a krevní buňky nejsou metodou zobrazeny. Barvení Blankophorem. Zvětšeno 510x. Řez mozkem člověka postiženého mykózou. Houbové buňky vyplňují lumen cévy a prorůstají její stěnu. Mozková tkáň a krevní buňky nejsou metodou zobrazeny. Barvení Blankophorem. Mikroskop FLUOVAL ZEISS Jena.  Zvětšeno 510x. (M. Hejtmánek, R. Koďousek)
Řez plicní tkání, ve které září stěny kulovitých buněk (adiaspor) mikroskopické houby Chrysosporium parvum var. crescens. Barvení Blankophorem. Zvětšeno 1390x. Řez plicní tkání, ve které září stěny kulovitých buněk (adiaspor) mikroskopické houby Chrysosporium parvum var. crescens. Barvení Blankophorem. Mikroskop FLUOVAL ZEISS Jena. Zvětšeno 1390x. (M. Hejtmánek)
Buňky mikroskopické houby Chrysosporium keratinophilum. Jádra fluoreskují žlutě, cytoplasma červeně. Mikrokultura na agarovém médiu po fixaci barvená akridinoranží. Zvětšeno 1690x. Buňky mikroskopické houby Chrysosporium keratinophilum. Jádra fluoreskují žlutě, cytoplasma červeně. Mikrokultura na agarovém médiu po fixaci barvená akridinoranží. Mikroskop FLUOVAL ZEISS Jena.Zvětšeno 1690x. (M. Hejtmánek)
Intermediární filamenta keratinového typu v buňkách linie BT 20 (karcinom prsu) kultivované in vitro. Nepřímá fluorescence (FITC), jádra (žlutě) dobarvena ethidium bromidem. Zvětšení 1540x. Intermediární filamenta keratinového typu v buňkách linie BT 20 (karcinom prsu) kultivované in vitro. Nepřímá fluorescence (FITC), jádra (žlutě) dobarvena ethidium bromidem. Mikroskop ICM 405 C, ZEISS, NSR. Zvětšení 1540x. (J. Bártek)