Konfokální mikroskopie

Světelným zdrojem je laserové záření. Konfokální mikroskop poskytuje mimořádně ostrý, kontrastní, vysoce informativní obraz s vysokým rozlišením. Struktury nacházející se nad a pod rovinou fokusace nemají téměř žádný vliv na kvalitu obrazu. Hloubka ostrosti je vždy minimální.

Princip: buněčné struktury, které chceme pozorovat, obarvíme fluorochromem. Laserový paprsek je zaostřen do zvolené roviny, která buňkou prochází jako imaginární řez.V této zvolené rovině dojde k osvícení preparátu laserovým paprskem a fluorochrom emituje viditelné záření. Získaný obraz je zaznamenán počítačem. Postupnou změnou zaostření je možné získat obraz z více rovin (imaginárních řezů) – od vršku až ke spodu buňky. Zde je nejlépe patrný rozdíl proti klasické fluorescenční mikroskopii, kde září fluorochrom ve všech optických rovinách najednou (nelze tedy určit, co je nahoře a co je dole, uprostřed, atd.).

Pokud následně chceme provést 3D rekonstrukci obrazu, vzdálenosti mezi jednotlivými rovinami snímání by měly být vždy menší než hloubka ostrosti jednotlivých snímků. Po pořízení snímků z více rovin (běžně cca 30-60) se jednotlivé snímky „poskládají“ podle osy z (seřadí nad sebe podle pořadí snímání). Takto získáme pro každý bod pozorovaného objektu konkrétní hodnotu jasu (pro daný fluorochrom). Poté lze měnit libovolně směr/úhel pohledu a tím pádem je možné objekt zobrazit z libovolné strany (zorného úhlu) - dokonce lze objekt zobrazit i z boku nebo zespodu (všechna obrazová data ze všech virtuálních „řezů“ jsou totiž uložena v PC). Vše je znovu vypočítáno pro nově zvolený směr/úhel pohledu (podle obrazových dat ze všech zobrazených vrstev) a následně je vygenerován pohled na objekt z námi zvoleného směru/úhlu. V současné době software již umožňuje také zobrazení 3D perspektivní - tj. takové, kdy bližší části objektu (buňky) se jeví jako větší než části vzdálenější. Softwarová simulace částečné průhlednosti/neprůhlednosti objektu je nutná, abychom mohli rozlišit, co je více nahoře nebo dole.

Pro dosažení vyšší ostrosti obrazu lze dále použít dekonvoluci.Dekonvoluce je matematická metoda korekce objektů. Je-li znám stupeň zkreslení (tj. lze ho matematicky popsat jako konvoluci pomocí funkcí bodových pokryvů), pak lze obraz podrobit dekonvoluci. Obraz po dekonvoluci se tak více podobá skutečnému tvaru objektu než obraz získaný mikroskopem a stává se tak ostřejší, s menším šumem a větším rozlišením. Prakticky se dekonvoluce provádí tak, že se pomocí konkrétného mikroskopu pořídí snímky malé latexové kuličky (známe její tvar) a podle získaných snímků se stanoví míra zkreslení dané optické soustavy. Následně je získaný obraz přepočítán tak, aby kulička byla zobrazena jako kulička. Tato korekce se poté používá i pro ostatní objekty. 

Je možné zároveň použít několik fluorochromů (poskytujících různou barvu excitovaného světla), kdy se každý fluorochrom naváže na jinou buněčnou strukturu. Potom je vhodnější použít tzv. sekvenční skenování – postupné snímání emitovaného záření různých fluorochromů, kdy se tyto fluorochromy liší i použitým laserem pro excitaci. Nejprve je získán kompletní obraz emitovaný jedním fluorochromem, potom dalšími. Preparát pochopitelně zůstává na stejném místě. Následně lze pomocí softwaru složit získané obrazy do jednoho. Díky tomuto postupu máme v místech překryvu fluorescenčního signálu lépe čitelný obraz.

Fotogalerie

Krevní kapilára ze sítnice - "optický řez". Červeně je značen kolagen 4. V levé horní části obrázku je snímek z jedné optické roviny (tj. jeden „řez“), při pohledu na větvenou kapiláru shora. Takto vypadá jednotlivý snímek z konfokálního mikroskopu. Pro 3D rekonstrukci obrazu je třeba následně přeostřit laserový paprsek na sousední optickou rovinu (nad nebo pod sejmutým obrazem) a sejmout nový snímek. Po pořízení více snímků (běžně cca 30-60) lze jednotlivé snímky „poskládat“ (seřadit nad sebe podle pořadí snímání). Potom získáme pro každý bod pozorovaného objektu konkrétní hodnotu jasu. Poté lze měnit libovolně směr/úhel pohledu a tím pádem je možné objekt zobrazit z libovolné strany (zorného úhlu) - všechna obrazová data ze všech virtuálních „řezů“ jsou totiž uložena v PC). Vše je znovu vypočítáno pro nově zvolený úhel pohledu (podle obrazových dat ze všech zobrazených vrstev) a následně je vygenerován pohled na objekt z námi zvoleného směru/úhlu. Tuto ukázku vidíme na sousedících dlouhých obrázcích: Hlavní obrázek je protnutý 2 zvolenými čárami, tyto čáry znázorňují imaginární řezy kapilárou ve směru shora dolů. Obrázek dole potom odpovídá pohledu z boku (zepředu) na imaginární řez v místě vodorovné čáry. Obrázek vpravo potom odpovídá pohledu z boku na imaginární řez v místě svislé čáry. Čáry protínající stěny kapiláry na bočních obrázcích znázorňují optickou rovinu (na ose z), na kterou byl laser zaostřen při pořízení snímku při pohledu shora.
Krevní kapilára z oční sítnice. Jedná se o kapiláru z předchozího snímku. Celkový obraz krevní kapiláry složený ze všech sejmutých optických „řezů“; bylo použito asi 60 optických „řezů“. Na tomto obrazu je již nastavená částečná „světelná propustnost“obrazu (částečná neprůhlednost). Byla aplikována i dekonvoluce.  
Krevní kapilára ze sítnice - 3D rekonstrukce obrazu, simulovaný pohled z boku.
Epiteloidní buňka z kultury (barvení cytoskeletu a jádra).
Purkyňovy buňky - upravený obraz.
Fibroblast – mikrotubuly a mikrofilamenta, pseudobarvy.